支原體(ti)(ti)是(shi)一種常見的細胞培養(yang)污染(ran)物(wu)，對科研成果的準(zhun)確性(xing)(xing)和可靠性(xing)(xing)構成威(wei)脅。為了有效(xiao)檢(jian)測和控制支原體(ti)(ti)污染(ran)，各(ge)國藥(yao)典均對支原體(ti)(ti)檢(jian)測方法進行了規定：
中國藥典2020版
<3301>支原體檢查法
規定：主細(xi)胞(bao)(bao)庫、工(gong)作細(xi)胞(bao)(bao)庫、病(bing)毒(du)種子批、對(dui)照細(xi)胞(bao)(bao)以及臨床(chuang)治療用(yong)細(xi)胞(bao)(bao)進行支(zhi)原體(ti)檢(jian)查(cha)時，應同時進行培(pei)養(yang)法(fa)和指(zhi)示(shi)細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養(yang)法(fa)(DNA染色法(fa))。病(bing)毒(du)類疫苗的病(bing)毒(du)收(shou)獲(huo)液、原液采用(yong)培(pei)養(yang)法(fa)檢(jian)查(cha)支(zhi)原體(ti);必要時，亦(yi)可(ke)釆用(yong)指(zhi)示(shi)細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養(yang)法(fa)篩選培(pei)養(yang)基。也可(ke)采用(yong)經國家藥品檢(jian)定機構(gou)認(ren)可(ke)的其他(ta)方法(fa)。
歐洲藥典EP
<2.6.7>Mycoplasmas
要(yao)求培(pei)養(yang)法和(he)指示(shi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)法同時(shi)(shi)檢測(ce)，并且更詳(xiang)細(xi)(xi)的介紹了NAT方法代替前1或2種方法的具(ju)體驗證(zheng)要(yao)求。直接(jie)NAT法可以在有細(xi)(xi)胞(bao)(bao)毒性的材料(liao)中(zhong)應用(yong)或需(xu)要(yao)快速方法時(shi)(shi)使(shi)用(yong)。細(xi)(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養(yang)富(fu)集后(hou)NAT方法適(shi)合于待(dai)檢樣品(pin)與指示(shi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)共培(pei)養(yang)一段時(shi)(shi)間后(hou)，從(cong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)和(he)上清(qing)中(zhong)提(ti)取核酸(suan)，再通過NAT檢測(ce)。
美國藥典USP
<63>Mycoplasma Tests
指(zhi)出需要用(yong)兩種方(fang)法檢(jian)測(ce)支(zhi)原(yuan)體污染(ran)：(A)瓊脂-肉湯(tang)培養(yang)法 (B)指(zhi)示細(xi)(xi)胞法。并提(ti)到(dao)經(jing)驗證的(de)核酸(suan)擴增方(fang)法(NAT)或酶學方(fang)法可(ke)以(yi)用(yong)于檢(jian)測(ce)支(zhi)原(yuan)體，但前提(ti)是(shi)該(gai)方(fang)法經(jing)驗證可(ke)與培養(yang)法和指(zhi)示細(xi)(xi)胞法等(deng)效(xiao)。
基(ji)于以(yi)上藥典，以(yi)下是對應(ying)的幾種檢測(ce)方法，為企業提(ti)供(gong)參考(kao)：
一、培養法
1. 技術優勢：經濟可(ke)靠，適用(yong)于最(zui)終確認疑(yi)似受(shou)污染的(de)細胞樣本(ben)。
2. 應用場景：適(shi)用于細胞培養實(shi)驗(yan)室和臨床(chuang)治療細胞的(de)支原體檢查(cha)。
3. 檢測要求：
使用精(jing)氨酸(suan)肉湯培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)和支原體瓊(qiong)脂培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)，樣品需在2~8°C下(xia)儲存不超過24小時，或在-20°C下(xia)長(chang)期(qi)保存。此外，每種(zhong)樣品接種(zhong)6支精(jing)氨酸(suan)肉湯培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)和3支半流體培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)，并在36°C下(xia)培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)29天，每隔3天觀察一次(ci)。
4. 結果判斷：液體(ti)顏色(se)變化(粉色(se)或黃色(se))或出現絮(xu)狀沉淀表(biao)示支原(yuan)體(ti)生長。
二、熒光指示細胞法
1. 技術優(you)勢：快速簡便，適合初(chu)步篩查。
2. 應用場(chang)景(jing)：適用于需要快速(su)評估支原體污(wu)染情況的(de)場(chang)景(jing)。
3. 檢測要(yao)求：
使用熒光染(ran)料(如煙酸己(ji)可堿)進行染(ran)色，觀(guan)察染(ran)料結合到(dao)支原體DNA中的(de)A-T區域，產生特征性的(de)熒光信號(hao)。使用熒光顯微鏡觀(guan)察熒光小點并(bing)記錄。
5. 結果判斷：熒(ying)光小(xiao)點(dian)的存在指示(shi)支原體(ti)污染。
三、PCR法
1. 技術優勢：快速、靈敏、特異(yi)性(xing)強，適用于精確檢測。
2. 應用場(chang)景：適用于(yu)需要(yao)高精(jing)度檢測的實(shi)驗室。
3. 檢測要求(qiu)：
使用PCR試劑盒進行擴增，樣品需(xu)在(zai)無菌條件下處理。PCR反應體(ti)系需(xu)嚴格控制，而后通過瓊脂糖凝膠(jiao)電泳觀(guan)察(cha)結(jie)果。
結果判斷：明亮條帶的位置(zhi)指示支原體的存在。
四、掃描電子顯微鏡法
1. 技(ji)術優勢(shi)：直觀準確(que)(que)，適用于最終確(que)(que)認。
2. 應(ying)用(yong)場景(jing)：適(shi)用(yong)于需要進行最終確認(ren)的樣本。
3. 檢測要(yao)求：
使(shi)用掃描電(dian)子顯(xian)微(wei)鏡直接觀察細胞中的支原體形態(tai)，并對(dui)樣(yang)本進行(xing)固定、脫(tuo)水、干燥和噴金等預處理(li)。
支原體(ti)感染會使培(pei)養細(xi)(xi)胞慢(man)慢(man)枯萎，因(yin)此(ci)對培(pei)養細(xi)(xi)胞定期(qi)進行支原體(ti)檢(jian)測(ce)非常重要(yao)。一般來說每1至(zhi)3個(ge)月就應該(gai)進行一次支原體(ti)檢(jian)測(ce)。將定期(qi)支原體(ti)檢(jian)測(ce)常規(gui)化堅持下(xia)去，是細(xi)(xi)胞培(pei)養實驗(yan)室應對支原體(ti)感染的關(guan)鍵。
上海(hai)諾(nuo)狄(di)是一家專注于微生(sheng)物技術(shu)研發、生(sheng)產和銷售的(de)高科技企業(ye)，公司產品(pin)(pin)(pin)包括(kuo)制藥(yao)工業(ye)用檢測無菌培養(yang)基(ji)平板、限度檢查培養(yang)基(ji)、無菌工藝模擬(ni)試驗(yan)培養(yang)基(ji)產品(pin)(pin)(pin)等，在工業(ye)生(sheng)產、食品(pin)(pin)(pin)生(sheng)產、農(nong)業(ye)生(sheng)產等領域都有廣泛的(de)應用。
上海諾狄支原體檢測成品培養基原材料品質(zhi)有保(bao)證，具有使用效期長、生產批次量大、靈敏度高、穩定性(xing)優(you)良，并(bing)且確保(bao)了滅菌效果。與諾狄合作的企業可享有價(jia)格(ge)優(you)惠以及恒溫轉車運輸服務。此外，諾狄承諾協助客戶找到(dao)窗(chuang)口期。
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